一、 实验仪器与试剂
表格一:实验仪器
仪器 | 厂家 | 型号 |
小型垂直电泳槽 | Biorad | 164-8001 |
转印槽 | Biorad | Trans-Blot |
脱色摇床 | 常州澳华 | TY-80B |
电泳仪 | 上海天能 | EPS-200 |
低温高速离心机 | 64R | BECKMAN |
酶标仪 | Thermo Scientific | Multiskan Spectrum |
表格二:试剂
试剂 | 厂家 |
RIPA 裂解液 | 碧云天 |
PMSF | Amresco |
BCA 蛋白定量试剂盒 | Thermo |
Tris | Amresco |
甘氨酸 | Amresco |
盐酸 | 国药集团 |
甲醇 | 国药集团 |
Tween 20 | 国药集团 |
SDS | 国药集团 |
TEMED | Sigma |
BSA | Sigma |
PVDF 膜 | Millipore |
HRP 标记的羊抗小鼠二抗 | 联科生物 |
化学发光检测试剂 | Thermo |
GAPDH 鼠单克隆抗体 | 联科生物 |
预染蛋白 marker | 碧云天 |
X 光胶片 | 柯达 |
二、 实验步骤
1、组织中蛋白上清液的制备和浓度测定
把组织剪切成细小的碎片;
加入 200μL 裂解液,在匀浆机中研磨,直至裂解液中组织消失;
充分裂解后,12000rpm 离心 5min,取上清。
取部分上清蛋白用 BCA 蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度,按如下步骤: ①按试剂盒说明书将 A 液和 B 液以 50:1 的比例配制成工作液;
②取 2000μg/mL 的 BSA 标准品,用 PBS(pH 7.4)稀释成 2000μg/mL、1500μg /mL、1000μg/mL、
750μg/mL、500μg/mL、250μg/mL、125μg/mL、25μg/mL、0μg/mL 共 9 个浓度梯度;
③取上清液 10μL,用 PBS 稀释 20 倍;
④每管中加 20μL 蛋白标准品或稀释后的上清液,再加上述工作液 0.2mL,37℃孵育 30min,
562nm 处测吸光度,记录 OD 值;
⑤根据蛋白标准品的浓度及相应 OD 值绘制标准曲线:
根据标准方程计算样品总蛋白浓度(mg/mL)
样品 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 |
OD 值 | 0.817611 | 0.438412 | 0.657716 | 0.675617 | 0.362568 | 0.817774 | 0.688089 | 0.477546 | 0.627511 |
0.991314 | 0.517018 | 0.814846 | 0.748083 | 0.460470 | 0.622999 | 0.574448 | 0.404516 | 0.700393 | |
均值 | 0.904462 | 0.477715 | 0.736281 | 0.711850 | 0.411519 | 0.720386 | 0.631268 | 0.441031 | 0.663952 |
浓度 |
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mg/mL | 21.46 | 9.27 | 16.66 | 15.96 | 7.38 | 16.21 | 13.66 | 8.22 | 14.59 |
2、Western-Blot 检测总蛋白中目的蛋白表达。
灌胶
①蒸馏水清洗灌胶玻璃板,竖直晾干。
②配制 13%分离胶 10mL,加 TEMED10μL、10%过硫酸铵 100μL,混匀后立即灌胶,灌至齿梳下缘 2~3mm(事先做好标记),用异丙醇封闭液面以去除气泡并隔绝空气,室温静置 45min 待胶*聚合。
③待分离胶*聚合后,倾去其顶部的去离子水,用滤纸将水吸干。
④配制 4%浓缩胶 5 mL,加 TEMED 5 μL、10%APS 50 μL,混匀立即灌胶,灌至顶部,并垂直插入 Teflon 齿梳,室温静置 20 min 待胶聚合。
⑤待胶*聚合后拔出梳子,将凝胶置于电泳槽中,加入电泳缓冲液,用电泳缓冲液冲洗上样孔以去除气泡。
电泳
①取各个处理组蛋白提取液,调整蛋白浓度为 6μg/μL,和等体积 2×上样缓冲液混合,即为上样液。
②将上样液于 100℃沸水中煮沸 5min,使蛋白变性,冰上骤冷,3000 转/min 离心 1min。
③每孔加上样液 15μL,留一孔加 10μL 预染的 Marker。加满电泳缓冲液,盖上槽盖,接通电源,先用 80v 恒压电泳,约 20min,当指示剂溴酚蓝进入分离胶后改用 110v 恒压电泳,当指示剂到达距凝胶下端约 0.5cm 处时关闭电源,取出胶板。
转印蛋白及免疫检测
①在电泳即将结束前,预先将 PVDF 膜浸泡在甲醇中 15s,然后用 ddH2O 漂洗 2min,浸泡于转移缓冲液中 5min 后开始后续操作。
②在水中撬胶,修胶后将胶浸泡于转移缓冲液中平衡 15min。
③按黑面(负极)→海绵→滤纸→胶→PVDF 膜→滤纸→海绵→红面(正极)的顺序制备转膜“三明治”,每层铺好后先赶走气泡再铺另一层。在转移缓冲液中制备三明治可避免气泡的产生。
④接上正负极,按膜向正极的方向将转移盒放入电转仪中,加入转膜缓冲液。
⑤将电转仪置于冰水中,100V 恒压转膜 1h。
⑥转膜结束后,快速取出 PVDF 膜,放入 5%BSA 室温封闭 2h。
⑦取出膜,于摇床上用 TBST 洗膜 5min×3 次。
⑧孵育袋中加入 TBST 稀释的一抗(1:500)4℃孵育过夜。
⑨TBST 洗膜 5min×3 次,辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗小鼠二抗(1:3000),室温孵育 1h。
⑩TBST 洗膜 10min×3 次。膜于化学发光检测试剂反应至暗处出现亮条带,取出膜,甩去多余的液体,用保鲜膜包好 PVDF 膜,暗室中用 X 胶片感光、显影、定影。