一、 实验仪器与试剂

 表格一：实验仪器

 表格二：试剂

二、 实验步骤

1、样本处理

4℃ 12000rpm 离心收集细胞，弃上清。PBS 清洗 1 遍后，加入 1mL Trizol 充分混匀。

2、两相分离 每个样品中加入 0.2 mL 的lv仿，盖紧管盖，剧烈振荡管体，室温静置 5min。4℃下 12000rpm

离心 15 min。离心后混合液体将分为下层的红色酚lv仿相，中间层和上层的无色的水相。RNA 全部被分配于水相中。水相的体积大约是匀浆时加入的 Trizol 试剂的 60%。

3、RNA 沉淀 将水相转移到新离心管中。加入等体积的异丙醇，水相与异丙醇混合以沉淀其中的 RNA。混匀并在室温孵育 10 min 后，4℃ 12000rpm 离心 10 min。

4、RNA 清洗 移去上清液，加入 1 mL 75%乙醇，清洗 RNA 沉淀。振荡后，4℃ 7500 rpm 离心5 min。

5、重新溶解 RNA 沉淀

去除乙醇溶液，空气中干燥 RNA 沉淀 5-10 min。溶解 RNA 时，先加入无 RNA 酶的水用枪反

复吹打几次，然后 55 到 60℃孵育 10 min。获得的 RNA 溶液保存于- 70℃。

6、反转录

1) 按下列组份配制 RT 反应液

2）反转录反应条件如下: 37℃ 15min，85℃ 5s。

3）反应结束后，将其放在冰上待用或-20℃保存。

7、荧光定量 PCR

引物设计

按下列组份配制 Realtime PCR 反应体系

用漩涡振荡器将管中溶液*混合均匀，短暂低速离心。

3）点样。将混合好的液体加入孔板中，每个样本的每个基因保证3个复孔,点完样之后将 PCR 板置于离心机中 2000rpm、2min，然后用锡箔纸将板包好，置于 4 度冰箱中备用。 4） PCR 反应

Real time PCR 仪使用 ABI7500,PCR 程序已优化 将步骤 3 中已点好样的 PCR 板置于 Realtime PCR 仪上进行 PCR 反应：首先是预变形：95℃/10min

第二步是循环反应 40 cycles : 95℃/15s; 60℃/45s(收集荧光) ;72℃/45s 第三步溶解曲线：95℃/15s; 60℃/1min ;95℃/15s

三、 结果与计算（采用 2 - △△ CT 法进行分析）

基因相对表达量

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