Tunel检测病理实验技术服务原理

晚期凋亡细胞中染色体DNA双链或单链断裂产生粘性3'-OH末端，在脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT)的催化下，将带有荧光素分子的dUTP标记到DNA的3'-末端，然后通过荧光显微镜观察、或进而用带有HRP的一抗染色后DAB显色，可以进行凋亡细胞的检测，该实验称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(terminal-deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL)。

Tunel检测可以标记组织细胞中发生凋亡的细胞，通过核复染计数细胞比例，可以计算一定组织细胞中发生凋亡的细胞比例，常用在各方向生物学研究中凋亡发生的检测以及定性比较。

实验流程

石蜡切片/冰冻切片/细胞爬片-脱蜡-通透-酶标记反应-HRP抗体,DAB显色，可白光拍照-核复染-观察拍照。

实验方法

对于贴壁细胞或细胞涂片

a. PBS或HBSS洗涤一次。

b. 如果细胞贴得不牢，可以干燥样品使细胞贴得更牢。

c. 用4%多聚甲醛或碧云天生产的免疫染色固定液(P0098)固定细胞30-60分钟。

d. 用PBS或HBSS洗涤一次。

e. 加入含0.1% Triton X-100的PBS，冰浴孵育2分钟。

f. 转步骤5。

对于悬浮细胞或细胞悬液

a. 收集细胞(不超过200万细胞)，PBS或HBSS洗涤一次。

b. 用4%多聚甲醛固定细胞30-60分钟。为防止细胞聚集成团，宜在侧摆摇床或水

平摇床上缓慢摇动的同时进行固定。

c. 用PBS或HBSS洗涤一次。

d. 用含0.1% Triton X-100的PBS重悬细胞，冰浴孵育2分钟。

e. 转步骤5。

对于石蜡切片

a. 二甲苯中脱蜡5-10分钟。换用新鲜的二甲苯，再脱蜡5-10分钟。无水乙醇5分钟。90%乙醇2分钟。70%乙醇2分钟，蒸馏水2分钟。

b.滴加20μg/ml不含DNase的蛋白酶K，20-37℃作用15-30分钟(不同组织的作用温度和时间需自行摸索)。

c. PBS或HBSS洗涤3次。注意：这一步必须把蛋白酶K洗涤干净，否则会严重干扰后续的标记反应。

d. 转步骤5。

对于冷冻切片

a. 用4%多聚甲醛固定细胞30-60分钟。

b. PBS或HBSS洗涤2次，每次10分钟。

c. 加入含0.1% Triton X-100的PBS，冰浴孵育2分钟。

d. 转步骤5。

对于贴壁细胞、细胞涂片或组织切片

a. 用PBS或HBSS洗涤2次。

b. 在样品上加50μl TUNEL检测液，37℃避光孵育60分钟。注意：孵育时需注意在周围用浸足水的纸或药棉等保持湿润，以尽量减少TUNEL检测液的蒸发。

c. PBS或HBSS洗涤3次。

d. 用抗荧光淬灭封片液封片后荧光显微镜下观察。可以使用的激发波长范围为450-500nm，发射波长范围为515-565nm(绿色荧光)。

对于悬浮细胞或细胞悬液

a. 用PBS或HBSS洗涤2次。

b. 加入50μl TUNEL检测液，37℃避光孵育60分钟。

c. PBS或HBSS洗涤2次。

d. 用250-500μl PBS或HBSS悬浮。

e. 此时可以用流式细胞仪进行检测或涂片后在荧光显微镜下观察。可以使用的激发波长范围为450-500nm，发射波长范

围为515-565nm(绿色荧光)。

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