产品货号：AV1501—A

产品名称：人尿源间充质干细胞分离培养试剂盒

Human urine- -derived mesenchymal stem cell isolation kit

人尿源间充质干细胞分离培养试剂盒产品描述：

该试剂盒为经过优化的低血清（2%V/V）尿源间充质干细胞（Urine-derived mesenchymal stem

cell, USC）分离培养基。用于选择性筛选泌尿系统来源的尿源间充质干细胞。低血清和选择性生长因子、激素的联合应用确保尿源干细胞在体外环境下的原代筛选和旺盛的增殖活力，配合人尿源间充质干细胞扩增试剂盒可在短时间内收获大量细胞。

注意事项：

·配好后避光2-8℃保存， 4周内使用完毕

·所有产品请于保质期内使用， 超过保质期， 必须放弃使用

·为确保产品质量，请避免反复冻融相关产品

尿源间充质干细胞(USC)原代提取

1、准备工作：

明胶包被：取适量0.1%明胶包被6孔板， 盖过孔底即可，铺平，放置37屯培养箱30分钟以上，备用

注意事项：

．包被明胶的培养皿在无茼和明胶不蒸干的条件下，可以在4℃保存两周。

2、尿液收集：

T75培养瓶或无茼取尿瓶表面喷75%酒精消毒，受试者戴无菌手套， 进行200ML或以上尿液收集

注意事项:

●收集尿液之前需对尿道外口进行消毒:男性尿道外口喷75%酒精;女性用75%酒精湿巾擦拭尿道外口3次

●避免晨尿，尽量留取清洁中段尿

●注意无菌操作，勿触摸瓶口，留取完毕后尽快封闭培养瓶拿至无菌操作间进行后续操作，室外放置

时间不宜过久

3、原代提取:

1) 75%酒精消毒尿瓶外表面，转移至超净工作台，用移液枪将尿液分装至50ml无菌离心管(4管左右)

2) 1500rpm，10min离心

3)取出明胶包被的六孔板，弃除多余明胶，放置工作台风干备用

4)离心完毕，弃尿上清，每管保留细胞沉淀不超过1ml

5)其中一管加入20ml PBS， 吹打混匀细胞沉淀

6)将细胞悬液转移至另一支离心管，吹打混匀，如此反复，直至将所有细胞沉渣悬液汇集于后一支离心管

7) 1500rpm，10min 离心

8)弃上清，12ml USC分离培养基重悬细胞沉渣，2ml/孔接种至六孔板， 记为P0-day1 (原代第1天)

9)此时光镜下可见大量漂浮尿源多边形角质细胞，培养皿放置379C培养箱

10)第2天，观察是否有污染情况(细菌污染:培养基浑浊变黄,镜下可见细沙状细菌)

11)第3或4天，每孔加1ml USC分离培养基

12)第5或6天半量换液(弃1ml，加1ml USC分离培养基)

13)第8天左右，光镜下可观察米粒样USC原代克隆形成

14)待克隆形成的形态稍大(第10天左右)，克隆形成孔进行全换液，即弃漂浮细胞，PBS清洗，添加

2mlUSC分离*培养基继续培养

15)待大片密集克隆细胞形成(第12天左右，融合度达90%以上)，0.25% EDTA- -胰酶消化(尤其细胞克隆密集的地方) , USC分离*培养基重悬细胞，根据细胞量传至6孔板或10cm培养皿，记为P1代。

16)细胞隔天换液，待P1代细胞融合率达90%左右，0.25% EDTA-胰酶消化，换用USC扩增*培养基重悬细胞，按1: 4比例传代，进行后续培养。

注意事项:

●一般正常人尿液中的细胞沉淀有时较少，离心后管底不易观察到，操作尽量轻柔，避免误吸

●一般正常人200ml尿量可出3~5克隆，较少情况下无克隆产生，与供者身体素质和时间有关

●USC细胞生长较快，待克隆集簇融合成大片，或内部生长空间较小时即可进行消化传代

●原代细胞培养一般不超过14天，若14天尚无克隆产生，可弃

●为获得活力旺盛的原代尿源干细胞，原代(P0)与P1代均需用USC分离*培养基进行选择性筛选，P2代开始换用USC分离*培养基

本尿源间充质干细胞分离*培养基经过原代尿液分离培养性能测试，详见附图(1, 2)

质量控制

√无菌检测(细菌、真菌和支原体检测)

√ pH测试

√渗透压检测

√内毒素检测

图一

附图1人尿源间充质干细胞原代提取流程图

附图2人尿源间充质干细胞原代提取、克隆形成图片(光镜: 100X )

day5~9可见米粒样集簇细胞克隆形成，day10~14细 胞克隆融合成大片可进行消化传P1代